הקדמה:

• ברגע שידוע לנו רצף הנוקלאוטידים של גנום, ניתן לבודד כל גן שרוצים.
• ניתן לייצר כמויות גדולות של תוצר הגנים אמצעות הכנסת הגן לחיידיקים או לתאים חיים. וניתן גם ליצור גנים במבחנה, ללא תאים.
• היכולת לייצר כמויות גדולות של חלבונים וממולקולות רנ"א נותנת לנו את היכולת להבין את התפקידים הביולוגיים של כל גן.

סוגי מניפולציות על דנ"א:

• חיתוך: של הדנ"א באתרים ספציפיים, כדי לבדוד גנים ולעשות עליהם מניפולציה.
• ליגציה: חיבור של דנ"א המאפשרת לחבר מולקולות דנ"א ממקורות שונים (לא בהכרח של אותו אורגניזם).
• שיבוט: גן בודד מטוהר משאר הגנום על ידי העתקתו
• היברידיזציה: של חומצות גרעין, זיהוי מדויק של רציפים ספציפיים של דנ"א או רנ"א על סמך היכולת לקשור באופן סלקטיבי רצף חומצות גרעין משלים.
• סינתזה: מאפשרת לבצע סינתזה כימית של מולקולות דנ"א בכל רצף של נוקלאוטידים, בין אם הרצף קיים בטבע ובין אם לא.
• ריצוף: קביעה מהירה של רצף הנוקלאוטידים של כל מולקולת דנ"א או רנ"א.

אנזימי רסטריקציה:

• נקראים בשם נרדף "נוקלאזות" - משפחה של אנזימים שהתפקיד שלהם הוא לחתוך חומצות גרעין.
• הן קיימות בחיידקים, ומטרתן למצוא דנ"א זר שחדר לתא, ולבצע בו חיתוכים כדי להגביל את היכולת שלו לפגוע בחיידק.
• הדנ"א של החיידק עצמו עובר מתילציה (סוג של תווית זיהוי) ובכך האנזימים לא חותכים אותו.
• שימוש מדעי:
  • מכיוון שדנ"א מורכב מתערובת בערך שווה של אותם ארבעה נוקלאוטידים, לא ניתן להפריד אותם בקלות.
  • לכן, אנזימי הרסטריקציה מבודדים מהחיידק וחותכים את מולקולת הדנ"א לרצפים בגדלים מוגדרים.
• סוגי קצוות שנוצרים בחיתוך:
  • קצוות דביקים (Sticky ends): חיתוך א-סימטרי היוצר קצה בולט (של 5' או 3'). מועדפים לחיבור מחדש בזכות קשרי המימן (קומפלמנטריות) שנוצרים בין הקצוות התואמים.
  • קצוות קהים (Blunt ends): חיתוך ישר וללא קצה בולט. נותנים יותר גמישות כשאין אתר רסטריקציה מדויק שמתאים לנו, אך החיסרון הוא שאין שליטה על האוריינטציה (הכיווניות) של החיבור, והם פחות ספציפיים ויעילים.
  • 

ג'ל אלקטרופוזה:

• משמש להפרדת חלבונים ומולקולות דנ"א.
• מכיוון שכל נוקלאוטיד נושא מטען שלילי, לא צריך להוסיף SDS (כמו ב- דף SDS).
• מקטעי דנ"א נודדים לפי הגודל שלהם, כאשר מקטעים גדולים יותר נודדים לאט יותר מכיוון שהתקדמותם מוגבלת במידה רבה יותר על ידי מטריקס הג'ל.
• הג'ל יכול להיות עשוי מסוגים שונים של חומרים, כאשר כל אחד מהם משמש לאורך שונה של מולקולת הדנ"א.

שיבוט דנ"א:

• המונח שיבוט דנ"א משמש לכמה מובנים:
  • הפעולה של הכנת עותקים רבים זהים של מולקולת דנ"א.
  • בידוד של דנ"א מסוים.
  • יצירת תאים רבים הזהים גנטית.
• תהליך השיבוט:
  • מתקיים ע"י הכנסת מקטע מסוים של דנ"א לגנום הדנ"א הנקי של מרכיב גנטי המשפכל את עצמו - בד"כ פלסמיד.
  • לוקחים את הפלסמיד, ומבצעים בו חיתוך בצורה מדורגת על ידי אנזימי רסטריקציה.
  • לוקחים את הגן שנרצה לבטא, ומאחים אותו אל הפלסמיד החתוך באמצעות ליגאז

פלסמיד:

• מולקולה קטנה ועגולה של דנ"א דו גדילי המופיעיה באופן טבעי בתאי חיידקים ומשכפלת באופן עצמאי מהדנ"א הכרומוזומלי של המארח.

• 

• אזורים חשובים בפלסמידים:

  • אזור ה - Origin of Replication:
    • אתר המאפשר לפלסמיד להשתכפל באופן עצמאי.
    • הוא בעל מנגנון ויסות הקובע את מספר העותקים אשר יהיה ניתן ליצור.
    • האזור גם קובע אם הפלסמיד יוכל להשתכפל רק בסוג אחד של חיידק, או בין מינים שונים.
    • אם נכניס שני פלסמידים שונים עם אותו סוג של ORI לאותו חיידק, הם יתחרו על משאבי השכפול ואחד מהם ידחה.
  • גן לעמידות באנטיביוטיקה:
    • כאשר אנחנו מנסים להכניס פלסמיד לחיידקים, הוא יקלט רק במספר מועט מהם, ונרצה לדעת להפריד את החיידקים בעלי הפלסמיד מהשאר.
    • כאן באה לידי ביטוי העמידות לאנטיביוטיקה - נזרע את החיידקים על צלחת פטרי שמכילה אנטיביוטיקה, כך שהחיידקים שלא קלטו את הפלסמיד ימותו ממנה, ואלו שישרדו הם החיידקים שמכילים את הפלסמיד, והם יצרו מושבות.
  • אתר חיתוך מרובה:
    • אזור בו יש הרבה אתרי הכרה לאנזימי רסטריקציה שונים, כדי שיהיה נוח לחתוך.

• שימוש בפלסמידים:

  • המגוון הרב של סוגי הפלסמידים (פלסמידי ביטוי, פלסמידים המשתיקים ביטוי גנטי, פלסמידי שיבוט, וכו') מאפשרים למדענים להשתמש בהם לטווח רחב של ניסויים. בין היתר:
    1. דימות פלורוסנטי.
    2. טכנולוגיות דנ"א רקומביננטי.
    3. יצור חלבון בכמויות גדולות.
    4. מודלים של מחלות.
    5. גילוי תרופות.
    6. עריכת גנום.

וקטור BAC (Bacterial Artifical Chromosome):

• מונח כללי לתיאור הדרך שבה מכניסים דנ"א מסויים לתא מארח.
• מכאן, שפלסמידים הם דוגמא ספציפית לווקטור.
• לעיתים, אם גודל הדנ"א הזר גדול מדי לפלסמיד, משתמשים בווקטור אחר.
• ייצור חלבונים רקומביננטיים:
  • על ידי שימוש בוקטורי ביטוי ניתן לייצר תרופות בסקאלה רחבה.
  • נהוג להוסיף תיוג כמו His-tag או GFP-tag כדי לעקוב אחריו.